Менеджмент пищевых аллергенов критически важен для производителей, ритейлеров и потребителей-аллергиков. Но что же представляют собой стратегии по мониторингу попадания незаявленных аллергенов в продукт?
Несмотря на то, что за последние годы существенно возросла осведомлённость об аллергенах и важности их менеджмента (как среди производителей, так и среди потребителей), незаявленные аллергены всё ещё остаются одной из самых частых причин отзывов. Кроме того, не прекратилось использование профилактической маркировки аллергенов (ПМА), то есть надписи «Продукт может содержать…». И то, и другое является результатом того, что международные нормативы не предусматривают максимально возможного содержания аллергенов. Это значит, что в менеджменте аллергенов решения следует принимать на основе нулевого допуска.
Подходы на основе риска активно используются как в менеджменте аллергенов, так и при принятии решения о ПМА. После многих лет исследований для некоторых групп аллергенов были установлены пороговые значения, вызывающие реакцию, с помощью клинических испытаний на добровольцах. Но открытым остаётся другой вопрос: насколько надёжны методы подсчёта содержания аллергенов на этапе производства? Вопрос особенно актуален для тех аллергенов, для которых пороговые значения не установлены (а значит, продукт должен содержать ровно 0% такого аллергена).
Количественные методы
Самый часто используемый способ анализа на аллергены – это иммунологический анализ на основе количественных методов твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, или ELISA) и качественного анализа боковых потоков. При иммунологическом анализе используются антитела, распознающие белки из аллергенного материала. В целом такой анализ обладает большой чувствительностью и специфичностью. Обе характеристики важны, потому что метод должен обнаруживать даже низкую концентрацию аллергена в сложной матрице из нескольких пищевых компонентов.
Что касается количественных методов, ELISA – самый популярный из них. Коммерческие наборы для обнаружения аллергенов производят несколько компаний, и их активно используют производители и внешние лаборатории. Однако не существует официально принятых методов анализа на аллергены (за исключением одного аллергена – глютена), с которыми можно было бы сравнивать эффективность многочисленных коммерчески доступных наборов для анализа.
Масс-спектрометрия (МС) – один из новейших методов обнаружения и подсчёта аллергенов. Метод МС основан на протеомике, то есть изучаемые образцы белков расщепляются специальными ферментами на пептиды, которые и будут подвержены анализу. Пептиды служат суррогатами белков, среди которых необходимо выявить аллергены. Как правило, МС работает не хуже или даже лучше, чем ELISA, в плане чувствительности и специфичности. Во многих ситуациях методы МС обнаруживают конкретные пептиды, а не присоединившиеся к ним антитела – это и есть источник преимуществ перед иммунологическим анализом. Если говорить более конкретно, на МС не влияет возможное изменение состава белков во время обработки продуктов. Однако в настоящее время методы МС не так популярны, как иммунологический анализ.
Параметры и пределы
Предел количественного определения (ПКО) метода – это минимальная концентрация, при которой метод даёт количественный результат с адекватным уровнем точности. Большинство наборов для ELISA обладает фиксированной калибровкой, и ПКО для них равен минимальному ненулевому значению. В инструкциях к ELISA обычно рекомендуют записывать результаты ниже ПКО не как нулевые, а именно как «ниже ПКО». В этих случаях ПКО определяет порог, концентрация аллергена выше которого означает некондиционный продукт. При идеальной точности в 100% образец с концентрацией аллергена, равной ПКО, будет давать неприемлемый результат в 50% случаев, а в остальных 50% – результат «ниже ПКО».
Так будет в любом количественном методе, где используются пороговые значения. Ситуация резко отличается в методах качественного анализа, при котором предел обнаружения означает концентрацию, при которой аллерген будет обнаружен с высокой вероятностью (обычно от 90 до 100%).
Точность – важный параметр любого метода анализа. Обычно она описывается с помощью относительного стандартного отклонения, также называемого коэффициентом вариации КВ. Этот коэффициент вычисляется как наблюдаемое стандартное отклонение, делённое на среднее значение. Процентные значения КВ могут совпадать, но абсолютные отклонения – различаться (абсолютное значение будет больше при высокой концентрации). Также полезно будет помнить, что при обычном распределении данных около 68% результатов попадёт в диапазон среднего ±КВ, а в диапазоне среднего ±2КВ окажется 95%. То есть если метод обладает КВ в 20%, а в анализируемом продукте 25 частиц аллергена на миллион, то метод может дать результат от 15 до 35 частиц на миллион.
Важно знать, что стандартное отклонение бывает трёх видов. При определении стандартного отклонения повторяемости анализ проводят в условиях, где максимальное число факторов эксперимента остаётся постоянным (к этим факторам относятся: помещение, время суток, сотрудник, проводящий анализ, используемое оборудование, его калибровка и др.). Стандартное отклонение воспроизводимости – это, наоборот, КВ, наблюдаемый при анализе одних и тех же образцов в разных лабораториях. Среднее значение между стандартным отклонением воспроизводимости и повторяемости называется промежуточной точностью.
Требования и недостатки количественных методов
Самое понятное из всех требований к методам анализа на аллергены – это необходимость осмысленных и универсальных единиц измерения. Многие группы, занимающиеся анализом, рекомендуют сообщать результаты в миллиграммах аллергенного белка на килограмм образца (мг/кг), или частицах на миллион. Эти рекомендации основаны на том факте, что именно такие данные анализируются во время оценки рисков. Важно: общая масса аллергенного белка не совпадает с растворимым белком, полученным путём экстракции. Общая масса аллергенного белка измеряется с помощью азотных методов, которыми можно анализировать растворимые и нерастворимые белки (например, методов Кжделдаля или Думаса).
Доступ к количественным методам должен быть не только у производителей, но и у нормативных органов, которые будут заниматься их валидацией. В качестве примера можно вспомнить США, где был введён норматив на маркировку ферментированных или гидролизованных продуктов «Без глютена», но при этом в нём не были указаны валидированные количественные методы тестирования на глютен. Этот норматив ввело Управление по саннадзору за качеством пищевых продуктов (FDA) в 2013 году, и верхний предел по глютену в таких продуктах составлял 20 частиц на миллион. На тот момент были доступны валидированные методы анализа сложных продуктов на глютен, однако валидация не распространялась на матрицы, прошедшие ферментацию и гидролиз. Это привело к тому, что во многих случаях количество глютена было подсчитано с ошибками. В FDA сделали вывод, что если нет научно обоснованных методов анализа ферментированных и гидролизованных продуктов на глютен, то необходим такой анализ до этапа ферментации и/или гидролиза, как и защита от случайного контакта с глютеном на дальнейших этапах производства.
Самый лучший способ оценить точность количественного метода – это анализ заранее составленных пищевых матриц. Если в матрице известно количество аллергена до различных этапов обработки (запекание, обжарка, ферментация, заморозка, сушка, окисление и др.), её многоэтапный анализ позволит понять – как обработка влияет на белковый состав продукта. Многочисленные исследования подтвердили, что обработка меняет такие характеристики аллергенов, как растворимость и молекулярная структура, а значит, и результаты количественного анализа. Однако изменения количественных параметров не всегда означают, что сам аллерген становится менее опасным или теряет способность вызвать аллергическую реакцию. Валидация пищевой матрицы, проходящей выбранные этапы обработки – лучший способ оценить эффективность анализа на аллергены в условиях, максимально близких к анализу конечного продукта. Несмотря на этот вывод, сделанный химиками, для многих методов оценка эффективности не включает анализ заранее составленных матриц.
Ещё один недостаток количественных методов – частое отсутствие межлабораторной валидации. Уверенность в том, что в разных лабораториях анализ одного и того же продукта на аллергены (одним методом или разными) даёт одни и те же результаты, необходима для валидации эффективности методов. Единственным аллергеном, прошедшим межлабораторную валидацию метода ELISA, на сегодняшний день является глютен; в случае других аллергенов разные лаборатории, тестирующие одинаковые образцы, часто дают сильно различающиеся результаты. Что касается методов МС, у них могут быть преимущества перед ELISA, однако межлабораторных данных по таким методам ещё меньше – это и есть один из барьеров, мешающих массовому внедрению МС.
Трудности, возникающие при межлабораторном изучении пищевых аллергенов, подчёркиваются ещё одним недостатком: общей нехваткой научной литературы об анализе на аллергены, особенно о заранее составленных образцах. Хотя подготовка таких образцов в специализированных лабораториях возможна, она является долгим и трудоёмким процессом. Общедоступные материалы с хорошо описанными характеристиками были бы идеальным решением, но высокий уровень ресурсов, требуемых для генерации таких материалов, остаётся преградой уже много лет.
Будущее количественных методов
Если учесть тенденцию последних лет (повышенное внимание к менеджменту аллергенов на основе риска), можно ожидать дальнейших исследований в области точных количественных методов анализа на аллергены, а также в области валидации самих методов, интерпретации данных и создания удобного интерфейса, который облегчит применение этих методов.
По мере того, как авторы количественных методов (как ELISA, так и МС) пытаются пройти формальную валидацию, стоит ожидать некоторых трудностей. Одна из самых важных задач – межлабораторная валидация, требующая активного сотрудничества лабораторий различных регионов и стран.
Источник: crispy.news
